Методы микроскопии

 Определение понятия

Микроскопические методы исследования – это способы изучения очень мелких, неразличимых невооруженным глазом объектов с помощью микроскопов. Широко применяются в бактериологических, гистологических, цитологических и других исследованиях.

Микроскопия - один из главных методов диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний, позволяющий определить вид возбудителя по форме, размерам, строению оболочки, цитоплазмы, ядра, взаиморасположению и способности окрашиваться определенными красителями; обнаружить яйца и личинки гельминтов, их фрагментов, вегетативных и цистных форм патогенных простейших.

Микроскоп – это оптический прибор, имеющий как минимум двухступенчатое увеличение. И одно из них принадлежит окуляру, который играет роль лупы. Только в отличие от бытовой лупы, окуляр имеет постоянное увеличение, его положение в микроскопе определено и жестко закреплено стандартом (высота окуляра).

Любой оптический микроскоп имеет базовые узлы, функциональное назначение которых не меняется от типа, класса прибора или страны производителя. Разница только в конструкторском и технологическом решениях, предложенных специалистами фирм-разработчиков, а также уровне мирового научно-технического прогресса. И как бы микроскоп не назывался – световой, цифровой, видеомикроскоп, фотомикроскоп, лазерный сканирующий микроскоп, анализатор изображения – в его основе будет базовый световой микроскоп, принцип которого был разработан еще Левингуком, Ньютоном, Карл Цейсом, Эрнстом Аббе.

Микроскоп – это оптико-механо-электрический прибор, объединяющий в себе три функциональные части:
· функция воспроизводящей системы – воспроизвести (создать, сформировать) изображение объекта таким образом, чтобы оно как можно точнее передавало детали объекта с соответствующим разрешением, увеличением, контрастом и цветопередачей;
· функция визуализирующей системы – передать изображение объекта, созданное воспроизводящей системой микроскопа, таким образом, чтобы оно с небольшим дополнительным увеличением (или без него) было видно достаточно резко на сетчатке глаза, фотопленке или пластинке, на экране телевизора или монитора компьютера;
· функция осветительной системы – создать световой поток, позволяющий осветить объект таким образом, чтобы воспроизводящая система микроскопа предельно точно могла выполнить свою основную функцию. При этом совместная работа обоих систем должна обеспечивать визуализацию изображения с использованием физико-химических свойств объекта.

Важнейшей характеристикой каждого объектива микроскопа является его разрешающая способность. Разрешающей способностью называется расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно (т.е. не сливаются в одну).

Для полного использования разрешающей способности иммерсионного объектива необходимо выполнять следующие основные правила:
1) Конденсор осветительного аппарата должен быть поднят до отказа (до уровня предметного столика).
2) Диафрагма конденсора полностью открыта.

Во всех без исключения случаях работа ведется с применением встроенной подсветки или плоского зеркала, так как конденсор рассчитан на работу с параллельными пучками света.
Одной из важных характеристик объектива является его свободное рабочее расстояние, т.е. расстояние между верхней поверхностью препарата и нижней поверхностью фронтальной линзы объектива при наведенном на фокус объективе. Эти расстояния следующие:
для объектива с увеличением 10х – 0,25 мм;
для объектива с увеличением 40х – 0,65 мм;
для объектива с увеличением 100х – 1,25 мм.
Знание этих расстояний необходимо для того, чтобы быстро сфокусировать объектив на препарат.

Классификация микроскопов

Микроскопы по объекту исследования можно разделить на следующие основные виды:
- микроскопы плоского поля – это микроскопы, оптическая схема которых обеспечивает воспроизведение объекта в двумерном пространстве – двумерное изображение. Объекты исследования – тонкие, в среднем, толщиной от 10 мм до 0,1 мм, просматриваемый слой от 1 мм до 0,001 мм. В этих микроскопах возможно наблюдение объемного изображения в пределах 100-200 мкм по высоте за счет особых способов освещения.
- стереоскопические микроскопы - это микроскопы, оптическая схема которых обеспечивает воспроизведение объекта в трехмерном пространстве – объемное, трехмерное изображение. Объекты исследования – габаритные, в среднем, толщиной от 100 мм до 1 мм, просматриваемый слой по высоте/глубине – от 50 мм до 0,5 мм, и плоские.
Конструктивно микроскопы могут быть выполнены в двух вариантах:
- прямые микроскопы (классическое построение схемы) – наблюдательная часть микроскопа расположена сверху объекта. Это относится к микроскопам плоского поля и стереомикроскопам.
- инвертированные микроскопы (перевернутое построение схемы) – наблюдательная часть микроскопа расположена снизу объекта. Это относится только к микроскопам плоского поля.

По построению изображения микроскопы можно разделить следующим образом:
- микроскопы светлого поля – на светлом фоне более темное изображение объекта. Освещение: обычный прямо проходящий свет.
- микроскопы с методом косого освещения – на сером фоне контрастное изображение объекта с неровным по толщине контуром. Освещение: обычный прямо проходящий свет частично перекрывается до того, как попадает объект.
- микроскопы с методом темного поля – на темном фоне более светлое изображение объекта или ярко блестящий контур объекта. Освещение:
а) в микроскопах проходящего света – обычный прямо проходящий свет полностью перекрывается до того, как попадает на объект;
б) в микроскопах отраженного света - обычный свет, проходя через кольцевую диафрагму с непрозрачным диском, по размеру перекрывающим выходной зрачок объектива.
- микроскопы с методом фазового контраста – дают возможность с максимальной степенью визуализации и детальности наблюдать на сером фоне более темное «объемное» изображение объекта, окруженное по контуру светлой полосой; при негативном (темнопольном) фазовом контрасте картина обратная. Освещение: обычный прямо проходящий свет перекрывается, но в два этапа – часть света до объекта, а затем после объекта прошедшая часть света перекрывается с ослаблением. При этом свет в виде светового кольца определенной площади проходит через объект, а затем после объекта – через полупрозрачное кольцо в объективе.
Кроме того в парке микроскопов имеются специализированные микроскопы :
- люминесцентные микроскопы – обеспечивают возможность наблюдения на темном фоне свечения объектов. Освещение: обычный прямо падающий свет определенной длины волны попадает на объект, изображение объекта строится в другой длине волны; выделение соответствующих областей спектра происходит с помощью сложной системы блоков интерференционных светофильтров.
- поляризационные микроскопы – на сером или темном фоне разноцветное, четкое или контрастное изображение. Освещение: обычный прямо проходящий свет с помощью поляризатора в осветительной системе превращается в линейно-поляризованный свет, после объекта с помощью анализатора происходит выделение из структуры изображения тех элементов, которые связаны с анизотропией объекта.
- микроскопы дифференциально-интерференционного контраста или интерференционного контраста – на однотонном цветном фоне яркое цветное «объемное» изображение или изображение того же цвета, что и фон, с окантовкой из другого цвета. Освещение: обычный прямо проходящий свет с помощью поляризатора в осветительной системе превращается в линейно-поляризованный свет, после объекта с помощью специальной призмы и анализатора происходит создание объемного цветного контрастного изображения.
- ультрафиолетовые и инфракрасные микроскопы – освещение и наблюдение объекта с помощью электронно-оптических преобразователей вне видимого диапазона: до 400 нм и свыше 700 нм.

- лазерные микроскопы - освещение и наблюдение объекта с помощью лазерного излучения (смотрите пример ниже).

Порядок работы со световыми микроскопами
· Проверить состояние осветительного аппарата: поднять конденсор, открыть его диафрагму, включить питание и для установки интенсивности освещения медленно повернуть ручку настройки яркости, в случае отсутствия встроенной подсветки, поставить плоское зеркало.
· Поместить на столик микроскопа исследуемый препарат и установить в фокусе сухой объектив (10х) на расстояние несколько меньше свободного рабочего расстояния.
· Глядя в окуляр, произвести предварительную установку освещения с помощью ручки настройки яркости (или вращая зеркалом).
· Медленно поднимая тубус макровинтом, добиться резкого изображения препарата.
· Поставив сухой (40х) или иммерсионный (100х) объектив, опускать тубус микроскопа под контролем глаза, глядя сбоку. Опустить объектив на расстояние меньше свободного рабочего и, глядя в окуляр, макровинтом медленно поднимать тубус до тех пор, пока не появится мелькание препарата. Точная установка достигается с помощью микровинта. Не следует делать микровинтом более половины оборота в одну или другую сторону.

Микроскопия неокрашенных объектов
При работе с нативным материалом необходимо соблюдать два основных принципа: не загрязнить исследуемый объект микроорганизмами, не заразить себя и окружающую среду. При микроскопии необходимо помнить, что рассматривание неокрашенного препарата возможно только с ограниченным освещением, путем опускания конденсора или уменьшением отверстия ирис-диафрагмы. Для микроскопии неокрашенных объектов используется окуляр 10х и объектив 10х.
При освещении с помощью встроенной подсветки осветителя или плоского зеркала ирис-диафрагма частично закрыта, конденсор опущен. С помощью макровинта устанавливается поле зрения и проводится обзор препарата. С целью обнаружения объекта все нативные (неокрашенные) препараты просматривают под малым увеличением с помощью макровинта. Для лучшего рассмотрения объекта или его отдельных фрагментов используется сухой объектив с увеличением 40х и освещенность, с помощью поднятия конденсора и открытия ирис-диафрагмы под контролем глаза.

Микроскопия окрашенных объектов
При микроскопии окрашенного препарата необходимо помнить, что рассматривание возможно только при полном освещении. Для микроскопии окрашенных объектов используется окуляр 10х и объектив 10х.
Ирис-диафрагма открыта, конденсор поднят. С помощью макровинта устанавливается поле зрения и проводится обзор препарата. Достигается максимальное освещение препарата. При малом увеличении делается обзор препарата для обнаружения четко выраженных полей зрения. Изучение препарата проводится под большим увеличением с применением сухой системы объектив 40х. Для микроскопии окрашенных препаратов биологической жидкости, мокроты, биологического материала применяется иммерсионная система объектив 100х с нанесением на предметное стекло иммерсионного масла.

Метод люминесцентной микроскопии
Люминесценция, основа многих современных методов биологических исследований, позволяет наблюдать за взаимоотношениями молекул внутри клеток.
Фактором качественной работы для всех методов люминесцентных исследований является скорость.
Основной целью современной люминесцентной микроскопии является визуализация всех измерений объекта.
Метод с большим эффектом может быть использован для ускорения диагностики ряда заболеваний.
Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждающего люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета.
Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями – флуорохромами. Центральная часть клеток и присутствующие в препарате посторонние микробные клетки не светятся.
Ускоренная диагностика, идентификация возбудителя, обнаружение специфических антител в биологическом материале, биологической жидкости и во внешней среде осуществляется методами МФА, МИФ с применением люминесцирующих сывороток:
- иммуноглобулины диагностические туляремийные люминесцирующие – диагностика туляремии;
- иммуноглобулины диагностические бруцеллезные люминесцирующие – диагностика бруцеллеза;
-иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические люминесцирующие – диагностика сибирской язвы;
-иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные антиспоровые адсорбированные флуоресцирующие – диагностика сибирской язвы;
-иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные адсорбированные лошадиные – диагностика холеры;
- антигенный препарат с хантавирусным антигеном - диагностика ГЛПС;
- иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие для быстрой диагностики гриппа, ОРВИ.
Антигены, вирусы гриппа и другие возбудители ОРВИ в инфицированных клетках по их характерной локализации выявляются в результате взаимодействия антигенов с противовирусными антителами, маркированными флуоресцеинизотиоцианатом, методом МИФ. Метод иммунофлуоресцентного анализа (МИФ) является высоко чувствительным и специфичным качественным иммунодиагностическим тестом. К числу преимуществ метода относится его исключительная простота и возможность быстрого (за 1-2 часа) анализа клинических материалов с распознаванием широкого круга возбудителей, включая вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирусы, аденовирусы, вирусы герпеса.

Источник: http://www.cgekuban.ru/publication/ilc/micro.php

Общий метод: наблюдение. Частный метод: микроскопирование.

Видео: Наблюдение коралла под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом.

Christine E. Farrar, Zac H. Forsman, Ruth D. Gates, Jo-Ann C. Leong, and Robert J. Toonen, Hawai'i Institute of Marine Biology at the University of Hawai'i, Manoa

No dyes or digital software produced the brilliant color of these corals—the glory is all their own. Fluorescent molecules, innate to the corals and to the red algae that live inside and nourish them, shine like Christmas lights under different wavelengths of light emitted by a confocal microscope.

When she saw the corals under the lens for the first time, "my jaw just dropped," says Ruth Gates, a coral biologist at the University of Hawai'i, Manoa, and the narrator of the video. "Most people think corals are inanimate rocks," she says. "We showcase how beautiful and dynamic they are as animals." In the video, which compiles the images into three-dimensional, time-lapse animations, corals extend and retract their glowing tentacles. Tiny creatures crawl over the corals, all part of a complex and threatened ecosystem. In the future, Gates says, it might be possible to use confocal microscopy to classify different coral species or diagnose coral disease by their fluorescent patterns. Prior to applying this technique, she says, "that was not even a facet in our thinking about coral biology."