Обратная транскрипция
Лекция 19. Нестабильность генома. Обратная транскрипция В 40-х годах Барбара Мак-Клинток, американский генетик, обнаружила мозаичность окраски зерен у кукурузы, небъяснимую законами Менделя и мутационной теорией. Она предположила, что некоторые гены могут менять свое место в геноме. Определение: мобильные генетические элементы (МГЭ) - это последовательности нуклеотидов, меняющие свою локализацию и копийность в геноме. Выделяют следущие классы МГЭ: 1. IS - вставочные элементы у прокариот. 2. Tn - транспозоны у прокариот. 3. Эписомы у прокариот. 4. Некоторые умеренные фаги. 5. Контролирующие элементы кукурузы. 6. Мобильные диспергированные гены у дрозофилы, мыши, человека. 7. Провирусы. В литературе "транспозоны" - все мобильные генетические элементы. Это элементы генома, которые меняют свое положение и копийность в геноме. Это самые простые транспозоны. Размер IS-элементов ~1000 п.н. На концах они содержат инвертированные повторы (~20 п.н.). IS- элементы содержат только один ген - ген транспозазы, фермента, обеспечивающего перемещение IS-элемента по геному. Транспозаза - это обобщеный термин. Разные транспозазы работают по-разному, но смысл общий: транспозаза вырезает ДНК в одном месте и вставляет в другое место генома. Перед геном в IS-элементе имеется промотор, за геном - слабый терминатор транскрипции. Не всегда РНК-полимераза останавливается на нем, она может продолжать транскрибировать и рядом стоящий участок генома до сильного терминатора. Помимо гена транспозазы Tn-транспозоны содержат один или несколько генов лекарственной устойчивости. Копийность транспозона возрастает при наличии провокационного фона (например, наличие в среде антибиотика, ген устойчивости к которому кодируется в транспозоне). Есть транспозоны, не содержащие гена транспозазы. Такие транспозоны содержат по краям IS-элементы.Размер транспозонов - 2.5-10 тыс. п. н. Всем транспозонам свойствен-но наличие прямых повторов, LTR (long terminal repeats - длинные концевые повторы) После перехода из основной ДНК в плазмиду транспозон может попасть с ней в другую бактерию, придавая новому хозяину ранее отсутствующую лекарственную устойчивость. Кроме того, при вырезании транспозона из геномной бактериальной ДНК захватываются участки генома одной бактерии, которые вместе с транспозоном переносятся в другую бактерию. Захват ДНК происходит, если эта ДНК находится между двумя транспозонами. Умеренные фаги -фаг может захватывать часть генетической информации одной бактерии и переносить ее в другую. Поэтому сегодня говорят о едином генофонде прокариот. Эффекты, вызываемые мобильными элементами - Внедрение мобильных элементов внутрь гена приводит к выключению гена. - Может нарушаться регуляция гена, если мобильный элемент внедряется между оператором и цистроном (у мобильного элемента есть свой промотор). - Вставка мобильного элемента может привести к экспрессии генов, которые не должны в данное время работать. Наличие мобильных элементов является фактором, способствующим незаконной рекомбинации. При незаконной рекомбинации перетасовываются гены, не имеющие отношения друг к другу. Мобильные элементы провоцируют образование делеций, инверсий, дупликаций. Все это - хромосомные мутации. Некоторые вирусы - на самом деле тоже мобильные элементы. В форме провируса они находятся в геноме клетки хозяина, а потом могут начать перемещаться. Это, например, онкорнавирусы, являющиеся ретровирусами. Молекулярные основы канцерогенеза Признаки трансформированной клетки 1. Неконтролируемое деление. Искажен клеточный цикл. Продолжителен S-период. Стадия G2 сведена к минимуму. Клетка вступает в митоз неготовой. Последствия: нарушения при расхождении хромосом. Высокая потребность в энергии. При этом в элокачественных клетках гликолиз (идущий без кислорода) превалирует над окислительным фосфорилированием. 2. Клетки перестают узнавать друг друга. Происходит утрата контактного торможения. Это связано с изменением мембранных белков - белков-рецепторов и пр. Нарушается адгезия (прилипание к поверхности). 3. Раковые клетки дедифференцированы. 4. Теории рака До 70-х годов существовало три теории рака: 1. Канцерогенная теория. Известны професиональные раковые заболевания: рак кожи у трубочистов, рак губы у кровельщиков и пр. Бензпирен - первый описанный канцероген. Определение: канцерогены - это вещества, повышающие частоту возникновения рака. Но в экспериментах с канцерогенами не все животные заболевали. 2. Генетическая теория. Появилась в 30-х годах. У лабораторных мышей известны высоко- и низкораковые лабораторные линии 3. Вирусная теория. В молоке мышей был найден "фактор молока" (вирус Битнера). Объединение всех этих теорий произошло в 50-х годах. Отечественный ученый Лев Зильбер высказал гипотезу, что причиной рака может быть вирус, который становится геном. Обратная транскрипция Определение: обратная транскрипция - это синтез ДНК по матрице РНК. Обратную транскрипцию обнаружили в 1970 г. Темин, Балтимор, Дульбеко, работавшие с вирусом саркомы Рауса (ВСР). Этот вирус вызывает саркому у кур. Это онкорнавирус (oncoRNA) - относится к ретровирусам. Определение: ретровирусы - это РНК-содержащие вирусы, в жизненный цикл которых входит стадия образования ДНК обратной транскриптазой и внедрение ее в геном клетки хозяина в форме провируса. Предпочтительного места внедрения провируса в геном нет. Это позволяет отнести его к мобильным генетическим элементам. В состав ретровируса входит две идентичные молекулы РНК. На 5'-конце имеется Сap, на 3'-конце - поли А-хвост. Фермент обратную транскриптазу вирус "носит" c собой. Геном ретровируса содержит 4 гена: gag - белок нуклеоида, pol - обратная транскриптаза, env - белок капсида (оболочки), onc - онкоген, ответственный за злокачественную трансформацию клетки. str5 = str3 - (short terminal repeat) короткий концевой повтор; U5, U3 - уникальные последовательности (U5 - 80 н., U3 - 200 н.); PB (primer binding site) - участок связывания затравки. На РВ садится (за счет комплементарности) tРНК и служит затравкой для синтеза ДНК. Синтезируется небольшой кусок ДНК. Обратная транскриптаза, обладая еще и активностью РНК-азы Н, удаляет РНК в гибриде с ДНК, а за счет идентичности str3 и str5 этот одноцепочечный участок ДНК взаимодействует с 3'-концом второй молекулы РНК, которая служит матрицей для продолжения синтеза цепи ДНК. Затем РНК-матрица уничтожается и по образовавшейся цепи ДНК строится комплементарная. Образованная молекула ДНК длиннее РНК. Она содержит LTR (U3 str 3(5) U5). В форме провируса она находится в геноме клетки хозяина. При митозе и мейозе передается дочерним клеткам и потомкам. Для экспрессии вирусных генов нужен толчок: канцерогены, изменения метаболизма в клетке хозяина, стресс. Большинство изученных вирусных онкогенов кодируют протеинкиназу, фермент, который фосфорилирует белки. Как правило - это тирозиновая протеинкиназа. В клетке есть собственные протеинкиназы, в том числе и тирозиновая, но гораздо более активны сериновая и треониновая. Гены, кодирующие клеточные протеинкиназы, обозначают oncc, вирусные - oncv. Oncc - клеточные гены, работающие в дифференцированных клетках. Oncc имеют интроны, oncv - не имеют. Oncv либо добавляет тирозиновую протеинкиназу - и сказывается дозовый эффект гена тирозиновой протеинкиназы, либо, по сравнению с клеткой, не имеющей oncv, клетка, его имеющая, фосфорилирует тирозин, а не серин или треонин, как обычно, то есть происходит смена мишени. В первую очередь это касается белков, присутствующих в клетке в большом количестве. Это белки цитоскелета (нарушение адгезии), мембранные белки (нарушение контактного торможения), гистоны (нарушение регуляции, компактизации, облегчение репликации ДНК). Ретровирусы скорее всего возникли в результате внедрения мобильных элементов в непосредственной близости от oncc генов. В дальнейшем oncc превратился в oncv, а клеточная полимераза - в обратную транскриптазу. Вирус начал самостоятельную жизнь. Стадия провируса говорит о его клеточном происхождении. В медицине рак - это злокачественная опухоль только эпителиальных тканей. Метастазы - возникающие опухоли в районах, удалённых от исходной опухоли. Рак - болезнь генома. Одним из путей активации oncc является такая перестройка генома, в результате которой рядом с онкогеном появляется новый регуляторный элемент, обеспечивающий его более активную транскрипцию. Другой путь - структурная мутация в протоонкогене, т.е. нормальном клеточном гене, способном превратиться в онкоген. Существуют антионкогены, или гены-супрессоры опухолей, подавление активности которых приводит к развитию опухолей. Природа белковых продуктов онкогенов и антионкогенов чрезвычайно разнообразна. К онкогенам относят некоторые гены белков - факторов роста, а также гены рецепторов факторов роста. Перепроизводство факторов роста или нарушение структуры их рецепторов может привести к более частому делению клеток. Изменения в генах, кодирующих белки - передатчики сигналов от рецепторов к ядру клетки, в основном, протеинкиназы различной специфичности, а также изменения экспрессии генов, ответственных за белковые факторы транскрипции, могут превратить нормальную клетку в раковую. Подавление активности генов, ответственных за рост и размножение клеток, осуществляется белковыми продуктами генов - супрессоров опухолей. Так, ключевая роль в разрешении на переход из одной фазы клеточного цикла в другую принадлежит белкам - циклинам. Только находясь в комплексе с циклинами, циклинзависимые протеинкиназы способны фосфорилировать белки мишени, необходимые для перехода в следующую фазу клеточного цикла. Специальные белки сканируют ДНК перед репликацией на предмет выявления нерепарированных повреждений. Если ДНК не проходит тест, то включаются системы реализации "запрограммированной смерти" - апоптоза, в результате чего разрушаются жизненно важные структуры клетки, в том числе хромосомы и цитоскелет. Апоптоз определяется большим числом генов, центральное место среди которых занимает ген, кодирующий белок с молекулярным весом 53 кДа, - ген p53. Этот ген поврежден в 50% всех опухолей человека. Когда он выведен из строя, клетки с поврежденной (мутантной) ДНК перестают выбраковываться и в них происходит накопление новых мутаций, которые могут затрагивать как протоонкогены, так и гены-супрессоры опухолей. Как правило, рак развивается у людей пожилого и старого возраста. Это связано с тем, что мутации возникают случайно - и вероятность накопления в клетке нужного для злокачественного превращения набора измененных генов увеличивается с годами. Посчитано, что в среднем в клетке человека должно накопиться 10 независимых мутаций, касающихся онкогенов и генов - супрессоров опухолей. Источники: Дымшиц Г.М. Молекулярная биология: http://www.medliter.ru/?page=get&id=012131 Ваша оценка:
|