NMDA-рецепторы

NMDA-рецепторы - это мембранные постсинаптические (в основном) и пресинаптические рецепторы к самому распространённому медиатору нервной системы - аминокислотному иону глутамату. Своё малопонятное название они получили за то, что к ним избирательно присоединяется не только глутамат, но и N-метил-D-аспартат, сокращённо - NMDA. Это модифицированная аминокислота, точнее, ион аминокислоты - аспартат, к которому присоединена метильная группа, а сама аминокилота относится не к L-, а к D-аминокислотам. По сокращённому наименованию этого вещества и были названы те рецепторы, которые этим веществом можно пометить - NMDA-рецепторы. Рецепторы эти являются ионотропными, то есть включают в себя ионофор - ионный канал с открывающейся и закрывающейся порой, через которую сквозь мембрану могут быстро проходить три вида ионов: Na⁺, K⁺, Ca²⁺. А вот Mg²⁺ в ней застревает и закрывает её словно пробкой. Выбить эту пробку и открыть для прохода других ионов пору может только деполяризация мембраны с -70 мВ до -50 - -30 мВ. Такую деполяризацию обеспечивают другие ионотропные рецепторы, расположенные на этом же участке посткинаптической мембраны - AMPA-рецепторы (они же, напомним, являются и ионными каналами для Na⁺). Только при этом условии или при отсутствии ионов магния NMDA-рецептор начинает пропускать внутрь клетки  Na⁺ и Ca²⁺ и выпускать наружу K⁺. В результате мембрана быстро деполяризуется, порождая нервный импульс, кроме того, наружная среда обогощается ионами калия, что создаёт условия для судорожной активности данного участка нервной ткани, а в нейрон попадает заметная порция ионов кальция. Именно заброс ионов кальция внутрь нейрона и является главным делом для NMDA-рецепторов. В зависимости от дозы эти ионы кальция могут запустить самые разные процессы внутри клетки вплоть до её перевозбуждения и даже до разрушения и гибели. Опаскность высокой активности NMDA-рецепторов налицо! Поэтому-то они и снабжены различными механизмами сдерживания и блокирования их активности.

Эти рецепторы настолько ценны для нервной системы и настолько удобны для управления работой синапсов, передающих возбуждение с одного нейрона на другой, что нервная система размещает их не только на постсинаптической мембране, но и на пресинаптической тоже. В этом случае они работают как ауторецепторы, то есть активируются выбросами медиатора из собственного пресинаптического окончания в условиях уже имеющейся в нём деполяризации. Пресинаптические NMDA-рецепторы (preNMDAR) на окончаниях мшистых (моховидных) волокон тонически увеличивают спонтанное высвобождение глутамата, а также облегчают индуцированное высвобождение медиатора в зависимости от частоты импульсации. В основе такой кратковременной пластичности пресинаптических окончаний лежит повышение пресинаптической концентрации Ca²⁺, а также высвобождение BDNF - нейротрофического фактора мозга. А обеспечивают эти явления как раз таки пресинаптические NMDA-рецепторы.

MDA-рецепторы - это не просто мембранные рецепторы к глутамату - а настоящие сложные рецепторно-канальные комплексы, имеющие множестов участков для связывания различных химических веществ (лигандов), управляющих состоянием и работой этого комплекса. NMDA-рецепторы потенциально способны хорошо пропускать через свою пору в клетку 3 вида ионов: Na⁺, K⁺,  Ca²⁺. За счёт входящего потока ионов кальция эти рецепторы могут запускать процессы перестройки своих синапсов в виде долговременной потенциации, вызывать процессы эксайтотоксичности и приводить свою клетку к гибели. Их роль является главной в процессах памяти и научения, а также в развитии судорожной активности мозга и эпилепсии. Мало того, действие этанола (этилового спирата, алкоголя) на NMDA-рецепторы, по-видимому, обусловливает многие эффекты от употребления людьми алкоголя.

Вот почему так важно разобраться в том, как NMDA-рецепторы устроены, как работают и как можно повлиять на их работу.

nmda2_animaciya.gif

Рисунок. Анимированная структурная формула NMDA-рецептора. Источник изображения: https://marinky.com/images/medchem/NMDA-2.gif

NMDA-рецепторы относятся к мембранным молекулярным глутаматным рецепторам. Глутаматные рецепторы могут быть метаботропными и обеспечивать передачу информационного сигнала от связавшегося с ними лиганда с поверхности мембраны в цитоплазму клетки, запуская в ней каскад биохимических реакций. Или же они могут быть ионотропными, то есть включать в себя ионный канал, способный при активации рецептора пропускать через свою пору ионы внутрь клетки или наружу в зависимости от их концентрации.

NMDA-рецепторы являются ионотропными, то есть способны пропускать через мембрану различные ионы. Эти реыепторы присутствуют в постсинаптической мембране почти всех глутаматергических синапсов, где они располагаются вместе с другими рецепторами глутамата, в частности с рецепторами а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазола пропионовой кислоты (AMPA).. 

Все ионотропные глутаматные рецепторы состоят из 4 субъединиц, формирующих белковую трубочку ионного канала и мембранную пору в центре этой трубочки, через которую и перемещаются ионы в случае её открытия. Правда, эта трубочка больше похожа на бублик (тор), чем на трубочку, потому что она коротенькая и толстенькая.

Все глутаматные рецепторы обладают модульной архитектурой, при этом каждая из субъединиц построена из 4х основных частей:

• 1) аминоконцевого домена (ATD), находящегося во внеклеточном пространстве,
• 2) лиганд-связывающего домена (LBD), находящегося также во внеклеточном пространстве,
• 3) трансмембранного домена (TD), расположенного внутри мембраны,
• 4) C-концевого домена (CTD), находящегося во внутриклеточном пространстве.

Сайты связывания как глутамата, так и глицина находятся между долями D1 и D2 соответствующих лиганд-связывающих доменов всех глутаматных рецепторов. Связывание агониста, активирующего рецептор и его канал, индуцирует процесс соединения долей, что, в свою очередь, приводит к открытию канала и активации рецептора. В то же время ни N-метил-D-аспартат, ни D-аспартат не способны активировать каинатные или AMPA-рецепторы.

Ионотропные глутаматные рецепторы принято подразделять на несколько основных типов в соответствии с лигандом, избирательно (селективно) активирующим именно данный тип глутаматного рецептора.

Типы глутаматных рецепторов

1. NMDA-рецептор, активируется N-метил-D-аспартатом.
2. AMPA-рецептор, активируется α-аминометилизоксазолилпропионовой кислотой.
3. KA-рецептор, активируется каиновой кислотой.

Где встречаются NMDA-рецепторы?

Они локализуются во всей ЦНС, но при этом состав рецептора из различных субъединиц зависит от региона мозга. Наибольшая плотность NMDA-рецепторов имеется в гиппокампе, миндалине, полосатом теле, а также в коре больших полушарий. При этом концентрация NMDA-рецепторов выше в ассоциативных зонах коры, чем в её проекционных зонах. В коре головного мозга NMDA-рецепторы сосредоточены преимущественно во фронтальной области, в инсуле (островке), в парагиппокампальной извилине, в передней поясной коре. Это подсказывает нам, что NMDA-рецепторы обеспечивают реализацию многообразных функций высших отделов головного мозга. При этом NMDA-рецепторы экспрессируются, как правило, на постсинаптической мембране.

Примечательно, что даже на постсинаптической мембране мышечного волокна млекопитающего присутствует популяция функционально активных NMDA-рецепторов в ацетилхолиновом нервной-мышечном синапси.

Характеристика NMDA-рецепторов

Строение NMDA-рецептора. NMDA-рецептор представляет собой гетеротетрамер, в который входят четыре из семи возможных субъединиц: GluNl, GluN2A, GluN2B, GluN2C, GluN2D, GluN3A, GluN3B. Каждая субъединица кодируется соответствующим собственным геном. За счёт сплайсинга субъединица GluNl может вдобавок иметь 8 вариантов.

Для нормального функционирования NMDA-рецептора ему необходимо обязательно иметь две субъединицы GluN1. Оставлиеся 2 места могут занимать субъединицы GluN2A, GluN2B) или GluN3 в любой комбинации.

Основными субъединицами NMDA-рецепторов, локализованными в переднем мозге у взрослых, являются GluN2A и GluN2B. Обычно в состав рецептора входят два представителя класса GluNl и два представителя класса GluN2.

Так как альтернативный сплайсинг порождает множественные изоформы субъединиц GluN, то это обусловливает различную структуру рецепторов в разных областях нервной системы. Это позволяет им реализовать различные функции. В онтогенезе меняется характер тетрамеров, то есть меняется конструкция NMDA-рецепторов. Так, по мере созревания мозга в нём снижается число субъединиц GluN2B, GluN2D, GluN3A, но растет число субъединиц GluN2A и GluN2C. Постепенно доля GluN2А-субъединиц становится больше доли GluN2B, что объясняется влиянием рилина - специального белка, воздействующего на нервные клетки.

Интересно, что NMDA-рецепторам с субъединицами GluN1/GluN3A для активации достаточно одного глицина. Эта разновидность рецепторов в большом количестве экспрессируется на нейронах медиальной хабенулы мышей и именно они ответственны за аверсивное поведение Подавление или удаление GluN1/GluN3A у лабораторных грызунов снижает аверсивные паттерны поведения — например, тревогу или пониженную активность.

По расположению относительно клеточной мембраны каждая субъединица NMDA-рецептора имеет внеклеточный домен (он торчит из мембнаны наружу), 4 трансмембранных домена (они проходят сквозь мембрану) и один внутриклеточный домен (он свешивается из мембраны в цитоплазму клетки).

Внеклеточные домены обеспечивают связывание глутамата и его аналогов (аспартата и N-метил-D-аспартата). У субъединиц GluN2 на внеклеточном домене расположен сайт связывания глутамата, аспартата и N-метил-D- аспартата, а у субъединиц GluNl имеется сайт связывания коагонистов глутамата, функцию которых выполняют аминокислоты глицин или серин. На внеклеточном домене также имеются участки гликозилирования.

Из четырёх трансмембранных доменов (Ml, М2, М3 и М4) каналообразующим является домен М2. На трансмембранных доменах расположены сайты, регулирующие проницаемость ионного канала. Среди них сайты для связывания ионов Mg²⁺ и Zn²⁺, выполняющих роль эндогенных отрицательных аллостерических модуляторов; сайт связывания протонов водорода; сайт связывания эндогенных положительных аллостерических модуляторов, или РАМ (полиаминов, т. е. спермина и спермидина), и, вероятно, экзогенных РАМ; сайт канальных блокаторов, или ионофор NMDA-рецепторов, т. е. сайт связывания экзогенных отрицательных аллостерических модуляторов типа фенциклидина, кетамина, мемантина, препарата МК-801. Предполагают, что этот сайт канальных блокаторов связывает и этиловый спирт, наличие которого во внутриутробном периоде приводит к гибели нейронов, что в дальнейшем может сказаться и на интеллекте, и на памяти.

Постсинаптическая плотность

Постсинаптическая плотность (PSD) представляет собой сборку из нескольких белков, которая является организующим центром для многих рецепторов и эффекторов, а также цитоскелета в постсинаптическом компартменте. Молекулы PSD можно разделить на несколько функциональных групп, таких как рецепторы нейротрансмиттеров, строительные белки, киназы и фосфатазы, а также молекулы адгезии. Протеомные подходы идентифицировали сотни компонентов PSD, включая мембранные белки, каркасные белки, сигнальные белки и белки цитоскелета. Белок PSD-95 является одним из наиболее распространенных белков в PSD: на его долю приходится ≈ 2% массы PSD. Он взаимодействует со многими белками благодаря своим трем доменам PDZ, домену SH3 и домену GK, а также может мультимеризоваться с образованием расширенного каркаса. PSD-95 играет доказанную роль в стимулировании созревания синапсов и регулировании синаптической силы и пластичности. Он также может напрямую взаимодействовать с NMDA-рецепторами и AMPA-рецепторами. PSD-95 представляет собой прототипный каркасный белок, присутствующий в возбуждающих синапсах и являющийся членом семейства мембраносвязанных гуанилаткиназ (MAGUK). PSD-95 специфически накапливается в возбуждающих постсинаптических мембранах и опосредует кластеризацию ионных каналов на поверхности клеток, таких как AMPA-рецепторы. Молекуле PSD-95 присуща активность кластеризации ионных каналов и активность самоолигомеризации. Кроме того, посттрансляционные модификации, такие как пальмитоилирование, обеспечивают PSD-95 динамическими регуляторными механизмами для точного определения количества синаптических AMPA-рецепторов.

Внутриклеточный домен NMDA-рецептора содержит сайты фосфорилирования/дефосфорилирования. Фосфорилирование осуществляются, соответственно, различными киназами, а дефосфорилирование - фосфатазами. Иначе говоря, внутриклеточный сайт тоже выполняет функцию регулятора состояния ионного канала. Причём изменения проницаемости ионного канал за счёт фосфорилирования являются довольно длительными.

Таким образом, NMDA-рецептор представляет собой рецепторноионофорный комплекс. По сравнению с AMPA-рецепторами NMDA-рецепторы имеют более высокое сродство к глутамату, а их ионный канал медленнее открывается и медленнее подвергаются десенситизации, чем канал АМРА-рецепторов.

Итак, NMDA-рецепторы, способные выполнять функции ионного канала, состоят из двух субъединиц GluN1 и двух субъединиц GluN2, либо двух субъединиц GluN1 и двух субъединиц GluN3. И главное - они имеют множество «кнопок управления».

Уникальность глутаматных NMDA-рецепторов заключается в том, что их активация осуществляется при одновременном связывании сразу двух лигандов-агонистов: глутамата субъединицей GluN2 и глицина субъединицей GluN1. Сам по себе глицин постсинаптических потенциалов не вызывает, но при полном отсутствии глицина их не вызывает сам по себе и глутамат.

Но, строго говоря, даже этих двух лигандов недостаточно, чтобы открыть канал NMDA-рецептора. Ведь этот канал в норме забит «магниевой пробкой» в виде иона магния Mg²⁺. Поэтому нужен третий фактор, для того чтобы открыть этот упрямый канал. Этим третьим фактором является деполяризация мембраны, на которой расположены NMDA-рецепторы. Её могут вызвать заработавшие на этой же постсинаптической мембране AMPA-рецепторы. Им для этого, по счастью, нужен только глутамат в качестве лиганда.

Итак, медиатор глутамат, поступая к постсинаптической мембране, открывает ионные каналы AMPA-рецепторов, через них внутрь клетки входят ионы Na⁺, вызывая деполяризацию мембраны. Деполяризация выбивает из каналов NMDA-рецепторов магниевую пробку. На свои сайты NMDA-рецепторов садятся, соответственно, глутама и глицин - и, наконец, канал NMDA-рецептора открывается для потока ионов. Снаружи через открывшийся канал внутрь клетки идут ионы Na⁺ и Ca²⁺, а изнутри наружу через него же выходят ионы K⁺.

Примечательно, что глицин, который в глицинергических синапсах выполняет функцию тормозного медиатора, в глутаматергических синапсах, имеющих NMDA-рецепторы, играет роль положительного эндогенного аллостерического модулятора.

risunoknmda.jpg

Рисунок. Структура NMDA-рецептора с примерным расположением сайтов связывания лигандов. Источник изображения:  Карлов Д.С. Моделирование структуры ионотропных глутаматных рецепторов и дизайн их лигандов. Дисс.канд.хим.наук. М., 2016. 

Особенности сайта рецептора для связывания в качестве лиганда NMDA

• Во-первых, объем сайта связывания агонистов в подтипах NMDA-рецептора оказывается существенно меньше, чем в каинатных и AMPA-рецепторах.
• Во-вторых, в непосредственной близости от аминогруппы находится молекула воды, которая, по-видимому, и позволяет NMDA-рецептору связывать N-метилированные аминокислоты, в частности, метилированную аминокислоту NMDA.

333px-nmda_receptor.jpg

Рисунок 2. Схематичное изображение NMDA-рецептора.

1. Клеточная мембрана.
2. Канал, блокируемый магнием Mg²⁺ (3).
3. Сайт блокировки Mg²⁺.
4. Сайт связывания галлюциногенов.
5. Сайт связывания цинка Zn²⁺.
6. Сайт связывания агонистов (глутамат) и\или антагонистов (APV).
7. Сайты гликозилирования.
8. Сайты связывания протонов (ионов водорода).
9. Сайты связывания глицина.
10. Сайт связывания полиаминов.
11. Внеклеточное пространство.
12. Внутриклеточное пространство.
13. Комплексная (сложная) субъединица.

Источник изображения: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:NMDA_receptor.jpg?uselang=ru

Механизм действия лигандов на лиганд-связывающий домен NMDA-рецептора

Лиганд-связывающий домен (речь сейчас идёт именно о домене, а не об ионном канале) может находиться в различных состояниях, по меньшей мере в двух: открытом и закрытом. Агонисты смещают равновесие к закрытому состоянию домена, что ведёт к изменению конформационного состояния петель, соединяющих трансмембранный домен с лиганд-связывающим, и открытию ионного канала. Таким способом агонисты открывают ионный канал. Антагонисты, наоборот, стабилизируют открытую форму домена связывания, и ионный канал остаётся закрытым.

Одним из первых изученных конкурентных антагонистов глицинового сайта NMDA-рецепторов является дихлоркинуреновая кислота. Сама исходная кинуреновая кислота, представляет собой продукт метаболизма триптофана, встречается в организме и также оказывает слабое антагонистическое действие на NMDA-рецепторы. Ксенон, одно из лучших средств для общего наркоза, также действует на NMDA-рецептор посредством связывания с его лиганд-связывающим доменом GluN1.

Блокаторы

Блокаторами канала NMDA-рецептора являются ионы Mg²⁺, полиамины спермин и спермидин, MK-801, кетамин, фенциклидин (PCP), производные аминоадамантанов, декстрометорфан, 9-аминотетрагидроакридин. Следует отметить, что лиганды данного типа отличает низкая селективность (избирательность) по отношению к подтипам GluN2. Например, MK-801 лишь в 10 раз эффективнее в случае каналов GluN2A/GluN2B, чем для GluN2C/GluN2D. Аминокислотные остатки, определяющие эффективность связывания блокаторов, неидентичны, однако находятся на первой и второй трансмембранных петлях, то есть входят в состав белковой трубочки, образующей ионный канал.

Механизм действия блокаторов NMDA-рецепторов

Блокаторы в качестве ингибиторов действует следующим образом: под действием агонистов открывается пора канала, в которую затем попадает блокатор, образующий водородную связь с остатком аспарагина в устье канала и механически препятствующий прохождению ионного тока через этот канал. Данный механизм хорошо объясняет корреляцию между вероятностью открытия канала и эффективностью ингибирования. Некоторые блокаторы имеют размер, позволяющий лиганду-блокатору оставаться в полости канала после его закрытия (PCP, MK-801, кетамин). Диссоциация такого комплекса происходит достаточно медленно и требует присутствия агониста. Некоторые исследования показывают, что связывание таких блокаторов, как амантадин, способствует последующему закрытию канала.

Аллостерическая регуляция NMDA-рецептора

Модуляторы глутаматных рецепторов интересны для медицинской химии по двум причинам: во-первых, они не активируют или блокируют глутаматергическую систему, а усиливают или ослабляют эффект от связывания эндогенного лиганда, то есть лиганда, который в норме присутствует в организме и используется для воздействия на мембранные рецепторы и ионные каналы. Во-вторых, связывание модулятора, как правило, происходит в сайтах, которые имеют низкое сходство аминокислотных последовательностей среди разных подтипов, что позволяет добиться большей селективности таких модуляторов.

Многие двухвалентные катионы способны влиять на деактивацию рецептора потенциал-зависимое блокирование канала.

Среди двухвалентных катионов .наиболее эффективно ингибируют NMDA-рецепторы ионы Zn²⁺. Внутриклеточные ионы цинка находятся в синаптических везикулах в гиппокампе, полосатом теле, коре головного мозга и, по-видимому, выделяются в синаптическую щель вместе с глутаматом, модулируя агонистический эффект. Анализ ингибирования цинком различных подтипов NMDA-рецептора позволяет предполагать наличие двух сайтов, связывание в которых влияет на ток через канал: высокоаффинного сайта, обеспечивающего потенциал-независимое ингибирование тока (IC₅₀ = 10-30 нM), и низкоаффинного сайта, связывание цинка в котором приводит к потенциал-зависимому блокированию (IC₅₀ = 20-100 мкM). Показано, что высокоаффинный сайт связывания цинка находится в аминоконцевом домене. При этом низкоаффинный сайт связывания цинка расположен рядом с остатками, образующими вход в фильтр селективности ионного канала.

Из всех глутаматных рецепторов к ингибированию (угнетению) ионом цинка склонны лишь те рецепторы, которые имеют субъединицы GluN2A или GluN2B. Скорее всего, ион цинка стабилизирует закрытую форму аминоконцевого домена за счёт дестабилизации поверхности контакта между лиганд-связывающими доменами.

Ион свинца Pb²⁺ ингибирует токи через рецептор по механизму, аналогичному механизму ингибирования ионом Zn²⁺.

Влияние pH, H⁺, протонов

Протоны, то есть ионы водорода H⁺, создающие кислую среду, измеряемую в pH, способны ингибировать все типы глутаматных рецепторов. Для NMDA-рецепторов величина ионного тока IC₅₀ в зависимости от типа GluN2-субъединицы колеблется в пределах pH=7.0-7.4. При этом ингибирование протонами не зависит от наличия связанного агониста или мембранного потенциала. Кинетически протоны уменьшают вероятность открытия канала, мало влияя на величину ионного тока и время открытия. Аминокислотные остатки, ответственные за pH-зависимое ингибирование, находятся на междимерном интерфейсе лиганд-связывающих доменов.

NMDA-рецепторы склонны к модуляции нейростероидами, при этом ненасыщенные сульфаты являются положительными модуляторами, а насыщенные планарные — отрицательными. Эффективность нейростероидов сильно зависит от типа субъединицы.

Полиненасыщенные жирные кислоты также способны к положительной модуляции NMDA-рецептора, увеличивая при этом вероятность открытия канала и не влияя на амплитуду ионного тока.

Фосфорилирование NMDA-рецепторов

NMDA-рецепторы могут фосфорилироваться со стороны цитоплазмы клетки следующими ферментами-протеинкиназами (киназами): серин/треонинкиназами, C (PKC), A (PKA), кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназой II (CaMKII), а также тирозинкиназами семейства Src и Fyn. В целом, фосфорилирование усиливает функцию фосфорилированного NMDA-рецептора.

Значительный процент субъединиц NMDA-рецепторов в головном мозге фосфорилируется PKC или PKA в одном или нескольких участках (10-70%, в зависимости от области мозга). Фосфорилирование с помощью PKC снижает сродство к внеклеточным ионам магния Mg²⁺ и увеличивает вероятность открытия ионного канала. Интересно, что приток ионов кальция через сам NMDA-рецептор может усиливать потенцирование, опосредованное PKC. 

Фермент Src тирозинкиназа фосфорилирует NMDA-рецепторы. Однако относительно небольшое количество субъединиц NMDA-рецептора на нейронных мембранах фосфорилируется по остаткам тирозина: всего 2-4%. Фосфорилирование, проводимое Src, усиливает функцию NMDA-рецепторов за счет снижения активности их Zn²⁺ блока.

Активация NMDA-рецепторов путем фосфорилирования может быть обращена вспять сериновыми и треониновыми фосфатазами 1, 2A и 2B (кальциневрин), а также эндогенными тирозинфосфатазами. Ингибирование активности эндогенной протеинтирозинфосфатазы приводило к потенцированию токов NMDA-рецептора, что указывает на то, что эти фосфатазы участвуют в определении уровня базального фосфорилирования NMDA-рецептора.

Мы можем сделать вывод о том, что NMDA-рецептор является многоцелевым регулятором работы постсинаптической (и пресинаптической) части возбуждающего глутаматергического синапса. Кроме того, он сам, в свою очередь, тоже подвергается сложной многонаправленной регуляции со стороны внеклеточных и внутриклеточных лигандов, для которых он имеет целый ряд различных сайтов связывания.

.